Cuantificación de Western blot: de la imagen del blot a la estadística
La cuantificación de un Western blot convierte las imágenes de las bandas en números comparables: mide el volumen de cada banda tras restar el fondo, normalízalo con un control de carga del mismo carril, exprésalo como cambio relativo (fold change) frente al control y haz las pruebas sobre réplicas biológicas. Esta guía recorre cada paso y muestra cómo hacerlo con el Gel Analyzer gratuito de LabTools.
En esta guía
- 1. Obtén una imagen que se pueda cuantificar
- 2. Encuentra los carriles y mide las bandas
- 3. Normaliza con un control de carga
- 4. Réplicas y estadística
- 5. Grafica e informa
- Preguntas frecuentes
Intensidad normalizada de las bandas para cuatro condiciones, con los 12 carriles a la vista y pruebas sobre las medias de las réplicas biológicas (n = 3). Ver el ejemplo completo
1. Obtén una imagen que se pueda cuantificar
La cuantificación solo es tan buena como la imagen. Usa el archivo original del equipo de imagen, idealmente un TIFF de 16 bits, no un JPEG, una captura de pantalla ni una figura con el contraste retocado. Elige una exposición en la que la banda más intensa que quieras medir no esté saturada: una banda recortada da un valor demasiado bajo y su volumen no sirve.
En LabTools, abre el Gel Analyzer y suelta la imagen (TIFF, PNG, JPG o BMP), o usa Open from LabTools para una imagen que ya esté en tus archivos. El paso Image indica la profundidad de bits, qué parte de la imagen está saturada y si las bandas son oscuras sobre fondo claro (la mayoría de los Western) o claras sobre fondo oscuro. Recorta y endereza aquí si hace falta.
2. Encuentra los carriles y mide las bandas
En el paso Lanes los carriles se detectan solos. Corrige el número en How many lanes? si es necesario, arrastra los carriles sobre la imagen para moverlos o inclinarlos, pon nombre a cada uno y asigna su función: muestra, marcador, control de carga o blanco.
En el paso Bands se mide cada banda. El perfil del carril muestra la señal de arriba abajo; la línea discontinua es el fondo que se resta y las zonas sombreadas son el volumen de cada banda. Si la línea base corta las bandas, prueba otro método de Background (el predeterminado recomendado es rolling ball más línea base del carril). Haz clic en un carril para añadir una banda y arrastra sus bordes para cambiar lo que se cuenta; las bandas editadas se vuelven amarillas.
Si hay un carril de marcador, el paso Ladder asigna un tamaño a cada banda (pb o kDa) a partir de marcadores de ADN y de proteínas integrados o de tus propios tamaños, y muestra el ajuste con su R².
3. Normaliza con un control de carga
El volumen bruto de una banda depende de cuánta proteína se cargó en el carril. En el paso Results, Quantify (Western blot) toma la banda diana y un control de carga (con un clic se elige la misma banda en todos los carriles) y divide una por otra:
- Normalize by → Loading control (same lane): una banda de una proteína de referencia (housekeeping) como GAPDH o actina.
- Normalize by → Total lane signal: el carril completo, una normalización de tipo proteína total.
- Fold change against: el carril control, para que cada valor se lea como múltiplo del control.
Para confirmar que estás en el rango lineal, usa Check the linear range with a dilution series: escribe la cantidad relativa cargada en cada carril de la dilución y LabTools indica cuán recta es la relación señal-carga para la diana y para el control de carga.
4. Réplicas y estadística
La unidad de análisis es la réplica biológica, no el carril. Los carriles del mismo lisado son repeticiones técnicas: promédialos primero y luego compara las condiciones con las medias de las réplicas. Tratar 12 carriles como n = 12 cuando hay 3 réplicas biológicas es pseudorreplicación y da valores p demasiado pequeños.
El botón Replicates del Gel Analyzer combina varios geles guardados (un gel por réplica), promedia los carriles con la misma etiqueta dentro de un gel y da la media, la DE y la n por condición, con una prueba t de Welch de cada condición frente al control, ajustada por Holm. Batch aplica un análisis guardado a un conjunto de imágenes para que todos los geles se midan igual.
Con tres réplicas por grupo, las pruebas de rangos no pueden alcanzar la significación (una prueba de Mann–Whitney con 3 frente a 3 no puede bajar de p = 0.081), así que lo habitual es una prueba t de Welch con corrección por el número de comparaciones. Consulta el ejemplo de Western blot para ver el conjunto completo de pruebas sobre datos con una forma realista.
5. Grafica e informa
Muestra todos los puntos, no solo una barra: un diagrama de caja o una barra con puntos deja ver la estructura de las réplicas. Envía la tabla de bandas a Charts & Plots, elige Box Plot y usa Statistical Testing para añadir corchetes con la prueba t de Welch y una corrección de Holm-Bonferroni o de Benjamini-Hochberg. Usa Export a 300–600 dpi o como SVG/PDF.
En los métodos, indica el origen de la imagen y su profundidad de bits, el método de fondo, la normalización, el número de réplicas biológicas y técnicas y la prueba. La página del ejemplo incluye un párrafo de métodos que puedes adaptar.
Preguntas frecuentes
¿Cómo se cuantifica un Western blot?
Mide el volumen de cada banda (su señal sumada sobre la banda, una vez restado el fondo), divídelo por un control de carga del mismo carril, exprésalo en relación con la condición control y compara las condiciones con réplicas biológicas. Usa la imagen original del equipo y asegúrate de que ninguna banda que cuantifiques esté saturada.
¿Proteína de referencia o proteína total para normalizar?
Se usan las dos. Una banda de referencia (GAPDH, actina, tubulina) es sencilla, pero puede saturarse o cambiar con el tratamiento; la proteína total del carril suele ser más robusta. Uses la que uses, también tiene que estar en su rango lineal. LabTools ofrece ambas como “Loading control (same lane)” y “Total lane signal”.
¿Cuántas réplicas necesito para un Western blot?
Al menos tres réplicas biológicas (muestras o experimentos independientes), cada una en su propio gel o conjunto de carriles. Los carriles técnicos del mismo lisado se promedian primero. Con n = 3 por grupo solo se detectan efectos grandes: en nuestro ejemplo, el efecto mínimo detectable con una potencia del 80% es d = 3.07.
¿Puedo cuantificar un JPEG o una captura de pantalla de mi blot?
Mejor no. La compresión JPEG y las capturas de pantalla cambian los valores de los píxeles y a menudo recortan el extremo brillante, así que los volúmenes dejan de ser fiables. Exporta el archivo original del equipo, idealmente un TIFF de 16 bits; el Gel Analyzer lo lee con su profundidad de bits completa.
¿Qué es el rango lineal y cómo lo compruebo?
Es el intervalo de cargas de proteína en el que la señal de la banda aumenta en proporción a la cantidad cargada. Carga una serie de diluciones de una muestra (por ejemplo 1, 2, 4 y 8 partes) y comprueba que la señal frente a la carga forma una recta. El Gel Analyzer tiene “Check the linear range with a dilution series”, que indica el R² (umbral de aprobación 0.98 por defecto).