Western blot 定量：从印迹图像到统计分析
Western blot 定量把条带图像变成可以比较的数字：测量每个条带扣除背景后的体积，用同一泳道的内参进行归一化，表示为相对于对照的倍数变化，并基于生物学重复进行检验。本指南逐步讲解每个环节，并演示如何在免费的 LabTools Gel Analyzer 中完成。
本指南内容
四种条件下的归一化条带强度，显示全部 12 条泳道，检验基于生物学重复的均值（n = 3）。 查看完整示例
1. 获取可以定量的图像
定量结果的好坏取决于图像。请使用成像仪导出的原始文件，最好是 16 位 TIFF，而不是 JPEG、截图或经过对比度调整的图片。选择一个曝光时间，使你要测量的最强条带没有饱和：被截断的条带读数偏低，其体积不能使用。
在 LabTools 中打开 Gel Analyzer，把图像拖进去（TIFF、PNG、JPG 或 BMP），或者对已在你文件中的图像使用 Open from LabTools。Image 步骤会报告位深、图像中饱和区域的比例，以及条带是浅底深带（大多数 Western）还是深底浅带。如有需要，可在此裁剪和校正倾斜。
2. 找到泳道并测量条带
在 Lanes 步骤中，泳道会被自动识别。如有需要，可在 How many lanes? 中修正泳道数，在图像上拖动泳道以移动或倾斜，给每条泳道命名并设置其角色：样品、Marker、内参或空白。
在 Bands 步骤中，每个条带都会被测量。泳道剖面图显示从上到下的信号；虚线是被扣除的背景，阴影区域是每个条带的体积。如果基线切入了条带，可以尝试另一种 Background 方法（推荐默认使用滚球法加泳道基线）。在泳道中点击可添加条带，拖动其边缘可改变计入的范围；编辑过的条带会变成黄色。
如果有 Marker 泳道，Ladder 步骤会根据内置的 DNA 和蛋白 Marker 或你自己输入的大小，确定每个条带的大小（bp 或 kDa），并显示拟合结果及其 R²。
3. 以内参归一化
原始条带体积取决于泳道中上样的蛋白量。在 Results 步骤中，Quantify (Western blot) 选取目标条带和一个内参（一次点击即可在每条泳道中选中同一条带），并用前者除以后者：
- Normalize by → Loading control (same lane)：管家蛋白条带，例如 GAPDH 或 actin。
- Normalize by → Total lane signal：整条泳道，即总蛋白式归一化。
- Fold change against：对照泳道，使每个数值都表示为对照的倍数。
要确认处于线性范围内，请使用 Check the linear range with a dilution series：输入每条稀释泳道的相对上样量，LabTools 会报告目标条带和内参的信号–上样量关系有多接近直线。
4. 重复与统计
分析单位是生物学重复，而不是泳道。来自同一裂解液的泳道是技术重复：先取平均，再基于重复的均值比较各条件。明明只有 3 个生物学重复，却把 12 条泳道当作 n = 12，就是伪重复，会让 p 值远远偏小。
Gel Analyzer 的 Replicates 按钮可合并多个已保存的凝胶（每个重复一块胶），对同一块胶上标签相同的泳道取平均，并给出每个条件的均值、SD 和 n，同时对每个条件与对照进行 Welch t 检验，并做 Holm 校正。Batch 可将一份已保存的分析应用到一组图像上，使每块胶都以相同方式测量。
每组只有三个重复时，秩检验无法达到显著（3 对 3 的 Mann–Whitney 检验最小只能到 p = 0.081），因此通常选择带多重比较校正的 Welch t 检验。完整的检验结果请参阅基于真实形态数据的 Western blot 示例。
5. 绘图与报告
要展示每一个数据点，而不只是一根柱子：箱线图或带散点的柱状图可以让重复结构一目了然。将条带表发送到 Charts & Plots，选择 Box Plot，并用 Statistical Testing 添加带 Welch t 检验以及 Holm-Bonferroni 或 Benjamini-Hochberg 校正的显著性标记。以 300–600 dpi 或 SVG/PDF 格式 Export。
在方法部分，请说明图像来源和位深、背景扣除方法、归一化方式、生物学重复和技术重复的数量以及所用检验。示例页面提供了一段可供改写的方法描述。
常见问题
如何对 Western blot 进行定量？
测量每个条带的体积（扣除背景后条带范围内信号的总和），除以同一泳道的内参，表示为相对于对照条件的值，并基于生物学重复比较各条件。请使用成像仪的原始图像，并确保要定量的条带都没有饱和。
归一化用管家蛋白还是总蛋白？
两种都有人用。管家蛋白条带（GAPDH、actin、tubulin）简单，但可能饱和，或随处理而变化；泳道总蛋白通常更稳健。无论使用哪种，它本身也必须处于线性范围内。LabTools 同时提供两种方式：“Loading control (same lane)”和“Total lane signal”。
Western blot 需要多少个重复？
至少三个生物学重复（独立的样品或实验），每个重复使用各自的凝胶或泳道组。来自同一裂解液的技术泳道先取平均。每组 n = 3 时，只能检测到较大的效应：在我们的示例中，80% 统计功效下的最小可检测效应为 d = 3.07。
可以对印迹的 JPEG 或截图进行定量吗？
应尽量避免。JPEG 压缩和截图会改变像素值，而且常常截断高亮部分，导致体积不可靠。请从成像仪导出原始文件，最好是 16 位 TIFF；Gel Analyzer 会以完整位深读取。
什么是线性范围？如何检查？
线性范围是指条带信号随上样量成比例增加的蛋白上样量范围。对同一样品上样一组稀释梯度（例如 1、2、4、8 份），检查信号对上样量是否呈直线。Gel Analyzer 提供“Check the linear range with a dilution series”，会报告 R²（默认合格线为 0.98）。