Western blot क्वांटिफिकेशन: blot इमेजपासून स्टॅटिस्टिक्सपर्यंत
Western blot क्वांटिफिकेशन बँड इमेजचे रूपांतर तुलना करता येण्याजोग्या संख्यांमध्ये करते: प्रत्येक बँडचा background-subtracted volume मोजा, तो त्याच lane मधील loading control ने normalise करा, control च्या तुलनेत fold change म्हणून मांडा, आणि biological replicates वर test करा. हा मार्गदर्शक प्रत्येक पायरी समजावतो आणि मोफत LabTools Gel Analyzer मध्ये ते कसे करायचे ते दाखवतो.
या मार्गदर्शकात
- 1. क्वांटिफाय करता येईल अशी इमेज घ्या
- 2. Lanes शोधा आणि बँड मोजा
- 3. Loading control ने normalise करा
- 4. Replicates आणि स्टॅटिस्टिक्स
- 5. Plot आणि अहवाल
- वारंवार विचारले जाणारे प्रश्न
चार conditions साठी normalised बँड intensity, सर्व 12 lanes दाखवल्या आहेत, आणि tests biological-replicate means (n = 3) वर आहेत. संपूर्ण उदाहरण पाहा
1. क्वांटिफाय करता येईल अशी इमेज घ्या
क्वांटिफिकेशन इमेजइतकेच चांगले असते. imager ची original फाइल वापरा, शक्यतो 16-bit TIFF, JPEG, screenshot किंवा contrast बदललेला फिगर नको. असा exposure निवडा ज्यात आपल्याला मोजायचा असलेला सर्वात तीव्र बँड saturated नसेल: clipped बँड कमी वाचला जातो आणि त्याचा volume वापरता येत नाही.
LabTools मध्ये Gel Analyzer उघडा आणि इमेज त्यात टाका (TIFF, PNG, JPG किंवा BMP), किंवा आपल्या फाइल्समध्ये आधीच असलेल्या इमेजसाठी Open from LabTools वापरा. Image पायरी bit depth, इमेजचा किती भाग saturated आहे, आणि बँड फिकट पार्श्वभूमीवर गडद आहेत (बहुतेक Westerns) की गडदवर फिकट हे सांगते. गरज असल्यास इथेच crop करा आणि सरळ करा.
2. Lanes शोधा आणि बँड मोजा
Lanes पायरीवर lanes आपोआप सापडतात. गरज असल्यास How many lanes? मध्ये संख्या दुरुस्त करा, lanes हलवण्यासाठी किंवा तिरप्या करण्यासाठी इमेजवर ड्रॅग करा, प्रत्येक lane ला नाव द्या आणि तिची भूमिका ठरवा: sample, ladder, loading control किंवा blank.
Bands पायरीवर प्रत्येक बँड मोजला जातो. Lane profile वरपासून खालपर्यंत signal दाखवतो; dashed रेषा काढून टाकलेला background आहे आणि छायांकित भाग प्रत्येक बँडचा volume आहेत. baseline बँडमध्ये कापत असेल तर दुसरी Background पद्धत वापरून पाहा (rolling ball plus lane baseline हा सुचवलेला डीफॉल्ट आहे). बँड जोडण्यासाठी lane मध्ये क्लिक करा, आणि काय मोजले जाते ते बदलण्यासाठी त्याच्या कडा ड्रॅग करा; एडिट केलेले बँड पिवळे होतात.
Ladder lane असल्यास Ladder पायरी अंगभूत DNA आणि protein ladders किंवा आपल्या स्वतःच्या आकारांवरून प्रत्येक बँडचा आकार (bp किंवा kDa) काढते, आणि fit त्याच्या R² सह दाखवते.
3. Loading control ने normalise करा
Raw बँड volume lane मध्ये किती protein घातले यावर अवलंबून असतो. Results पायरीवर Quantify (Western blot) target बँड आणि एक loading control घेते (एका क्लिकने प्रत्येक lane मधील तोच बँड निवडला जातो) आणि एकाला दुसऱ्याने भागते:
- Normalize by → Loading control (same lane): GAPDH किंवा actin सारखा housekeeping बँड.
- Normalize by → Total lane signal: संपूर्ण lane, total-protein प्रकारचे normalisation.
- Fold change against: control lane, म्हणजे प्रत्येक मूल्य control च्या पटीत वाचले जाते.
आपण linear range मध्ये आहात याची खात्री करण्यासाठी Check the linear range with a dilution series वापरा: प्रत्येक dilution lane मध्ये घातलेली relative मात्रा टाइप करा आणि LabTools target आणि loading control साठी signal-विरुद्ध-load रेषा किती सरळ आहे ते सांगते.
4. Replicates आणि स्टॅटिस्टिक्स
विश्लेषणाचे एकक biological replicate आहे, lane नाही. एकाच lysate मधील lanes technical repeats आहेत: आधी त्यांची सरासरी घ्या, मग replicate means वर conditions ची तुलना करा. 3 biological replicates असताना 12 lanes ला n = 12 मानणे म्हणजे pseudoreplication, आणि त्यामुळे p-values खूपच लहान येतात.
Gel Analyzer चे Replicates बटण सेव्ह केलेले अनेक जेल (प्रत्येक replicate साठी एक जेल) एकत्र करते, एका जेलवरील एकाच label च्या lanes ची सरासरी घेते, आणि प्रत्येक condition साठी mean, SD आणि n देते, सोबत प्रत्येक condition ची control शी Welch t-test ने तुलना, Holm-adjusted. Batch एक सेव्ह केलेले विश्लेषण इमेजच्या संचावर लागू करते, म्हणजे प्रत्येक जेल एकाच पद्धतीने मोजला जातो.
प्रत्येक group मध्ये तीन replicates असताना rank tests significance गाठू शकत नाहीत (3 विरुद्ध 3 वर Mann–Whitney test p = 0.081 च्या खाली जाऊ शकत नाही), त्यामुळे comparisons च्या संख्येसाठी correction सह Welch t-test हा नेहमीचा पर्याय आहे. खऱ्यासारख्या डेटावरील tests चा संपूर्ण संच पाहण्यासाठी western blot उदाहरण पाहा.
5. Plot आणि अहवाल
फक्त bar नव्हे, प्रत्येक data point दाखवा: box plot किंवा points असलेला bar replicate ची रचना स्पष्ट दाखवतो. बँड टेबल Charts & Plots मध्ये पाठवा, Box Plot निवडा, आणि Welch’s t-test आणि Holm-Bonferroni किंवा Benjamini-Hochberg correction असलेले brackets जोडण्यासाठी Statistical Testing वापरा. 300–600 dpi वर किंवा SVG/PDF म्हणून Export करा.
Methods मध्ये इमेजचा स्रोत आणि bit depth, background पद्धत, normalisation, biological आणि technical replicates ची संख्या आणि test नमूद करा. उदाहरण पेजवर एक methods परिच्छेद आहे जो आपण आपल्या गरजेनुसार बदलू शकता.
वारंवार विचारले जाणारे प्रश्न
Western blot कसा क्वांटिफाय करतात?
प्रत्येक बँडचा volume मोजा (बँडवर बेरीज केलेला त्याचा signal, background काढून), तो त्याच lane मधील loading control ने भागा, control condition च्या तुलनेत मांडा, आणि biological replicates वर conditions ची तुलना करा. imager ची original इमेज वापरा आणि आपण क्वांटिफाय करत असलेला कोणताही बँड saturated नाही याची खात्री करा.
Normalisation साठी housekeeping protein की total protein?
दोन्ही वापरले जातात. Housekeeping बँड (GAPDH, actin, tubulin) सोपा आहे पण saturate होऊ शकतो किंवा treatment ने बदलू शकतो; lane मधील total protein अनेकदा अधिक विश्वासार्ह असते. जे वापराल तेही आपल्या linear range मध्ये असले पाहिजे. LabTools दोन्ही देते: “Loading control (same lane)” आणि “Total lane signal”.
Western blot साठी मला किती replicates लागतील?
किमान तीन biological replicates (स्वतंत्र samples किंवा प्रयोग), प्रत्येक आपापल्या जेल किंवा lane संचावर. एकाच lysate मधील technical lanes ची आधी सरासरी घेतली जाते. प्रत्येक group मध्ये n = 3 असताना फक्त मोठे effects ओळखता येतात: आमच्या उदाहरणात 80% power वर minimum detectable effect d = 3.07 आहे.
मी माझ्या blot चा JPEG किंवा screenshot क्वांटिफाय करू शकतो का?
ते टाळा. JPEG compression आणि screenshots pixel values बदलतात आणि अनेकदा तेजस्वी भाग clip करतात, त्यामुळे volumes अविश्वसनीय होतात. imager मधून original फाइल एक्सपोर्ट करा, शक्यतो 16-bit TIFF; Gel Analyzer ती पूर्ण bit depth वर वाचतो.
Linear range म्हणजे काय आणि ती कशी तपासायची?
ही protein load ची अशी range आहे जिच्यात बँड signal घातलेल्या मात्रेच्या प्रमाणात वाढतो. एका sample ची dilution series लोड करा (उदा. 1, 2, 4, 8 भाग) आणि signal विरुद्ध load ही सरळ रेषा आहे का ते तपासा. Gel Analyzer मध्ये “Check the linear range with a dilution series” आहे, जे R² सांगते (डीफॉल्ट pass mark 0.98).