Quantifier un Western blot : de l’image du blot aux statistiques
Quantifier un Western blot, c’est transformer des images de bandes en valeurs comparables : mesurer le volume de chaque bande après soustraction du fond, le normaliser à un contrôle de charge de la même piste, l’exprimer en facteur de variation par rapport au contrôle, et tester sur des réplicats biologiques. Ce guide détaille chaque étape et montre comment la réaliser dans le Gel Analyzer gratuit de LabTools.
Dans ce guide
- 1. Obtenir une image quantifiable
- 2. Repérer les pistes et mesurer les bandes
- 3. Normaliser à un contrôle de charge
- 4. Réplicats et statistiques
- 5. Tracer et rapporter
- Questions fréquentes
Intensité normalisée des bandes pour quatre conditions, les 12 pistes affichées, avec des tests sur les moyennes des réplicats biologiques (n = 3). Voir l’exemple complet
1. Obtenir une image quantifiable
Une quantification ne vaut que ce que vaut l’image. Utilisez le fichier original de l’imageur, idéalement un TIFF 16 bits, pas un JPEG, une capture d’écran ou une figure dont le contraste a été retouché. Choisissez une exposition où la bande la plus intense à mesurer n’est pas saturée : une bande écrêtée est sous-estimée et son volume est inutilisable.
Dans LabTools, ouvrez le Gel Analyzer et déposez-y l’image (TIFF, PNG, JPG ou BMP), ou utilisez Open from LabTools pour une image déjà présente dans vos fichiers. L’étape Image indique la profondeur de bits, la part de l’image qui est saturée et si les bandes sont sombres sur fond clair (la plupart des Westerns) ou claires sur fond sombre. Recadrez et redressez ici si besoin.
2. Repérer les pistes et mesurer les bandes
À l’étape Lanes, les pistes sont détectées pour vous. Corrigez leur nombre dans How many lanes? si besoin, faites glisser les pistes sur l’image pour les déplacer ou les incliner, nommez chaque piste et indiquez son rôle : échantillon, marqueur de taille, contrôle de charge ou blanc.
À l’étape Bands, chaque bande est mesurée. Le profil de la piste montre le signal de haut en bas ; la ligne pointillée est le fond retiré et les zones ombrées sont le volume de chaque bande. Si la ligne de base mord sur les bandes, essayez une autre méthode de Background (le « rolling ball » plus ligne de base de piste est le réglage recommandé). Cliquez dans une piste pour ajouter une bande, faites glisser ses bords pour modifier ce qui est compté ; les bandes modifiées passent en jaune.
Avec une piste de marqueur, l’étape Ladder donne la taille de chaque bande (bp ou kDa) à partir des marqueurs d’ADN et de protéines intégrés ou de vos propres tailles, et affiche l’ajustement avec son R².
3. Normaliser à un contrôle de charge
Le volume brut d’une bande dépend de la quantité de protéines déposée dans la piste. À l’étape Results, Quantify (Western blot) prend la bande cible et un contrôle de charge (un clic sélectionne la même bande dans chaque piste) et divise l’une par l’autre :
- Normalize by → Loading control (same lane) : une bande de protéine de ménage comme GAPDH ou l’actine.
- Normalize by → Total lane signal : la piste entière, une normalisation de type protéines totales.
- Fold change against : la piste contrôle, pour que chaque valeur se lise comme un multiple du contrôle.
Pour vérifier que vous êtes dans la plage linéaire, utilisez Check the linear range with a dilution series : saisissez la quantité relative déposée dans chaque piste de dilution, et LabTools indique à quel point la relation signal-charge est linéaire pour la cible et pour le contrôle de charge.
4. Réplicats et statistiques
L’unité d’analyse est le réplicat biologique, pas la piste. Les pistes issues du même lysat sont des répétitions techniques : faites-en d’abord la moyenne, puis comparez les conditions sur les moyennes des réplicats. Compter 12 pistes comme n = 12 alors qu’il y a 3 réplicats biologiques, c’est de la pseudo-réplication, et les valeurs p deviennent beaucoup trop petites.
Le bouton Replicates du Gel Analyzer combine plusieurs gels enregistrés (un gel par réplicat), fait la moyenne des pistes de même étiquette sur un gel, et donne la moyenne, l’écart-type et n par condition, avec un test t de Welch de chaque condition contre le contrôle, ajusté par Holm. Batch applique une analyse enregistrée à une série d’images pour que chaque gel soit mesuré de la même façon.
Avec trois réplicats par groupe, les tests de rangs ne peuvent pas atteindre la significativité (un test de Mann–Whitney sur 3 contre 3 ne descend pas sous p = 0.081) : le choix habituel est donc un test t de Welch avec une correction pour le nombre de comparaisons. Consultez l’exemple de Western blot pour l’ensemble des tests sur des données réalistes.
5. Tracer et rapporter
Montrez chaque point de données, pas seulement une barre : une boîte à moustaches ou une barre avec ses points rend la structure des réplicats visible. Envoyez le tableau des bandes vers Charts & Plots, choisissez Box Plot et utilisez Statistical Testing pour ajouter des crochets avec le test t de Welch et une correction de Holm-Bonferroni ou de Benjamini-Hochberg. Faites un Export à 300–600 dpi ou en SVG/PDF.
Dans les méthodes, indiquez la source de l’image et sa profondeur de bits, la méthode de soustraction du fond, la normalisation, le nombre de réplicats biologiques et techniques et le test. La page d’exemple contient un paragraphe de méthodes que vous pouvez adapter.
Questions fréquentes
Comment quantifier un Western blot ?
Mesurez le volume de chaque bande (son signal additionné sur la bande, fond retiré), divisez-le par un contrôle de charge de la même piste, exprimez-le par rapport à la condition contrôle, et comparez les conditions sur des réplicats biologiques. Utilisez l’image originale de l’imageur et assurez-vous qu’aucune bande quantifiée n’est saturée.
Protéine de ménage ou protéines totales pour la normalisation ?
Les deux sont utilisées. Une bande de protéine de ménage (GAPDH, actine, tubuline) est simple, mais peut saturer ou varier avec le traitement ; les protéines totales de la piste sont souvent plus robustes. Quel que soit votre choix, le contrôle doit lui aussi être dans sa plage linéaire. LabTools propose les deux : « Loading control (same lane) » et « Total lane signal ».
Combien de réplicats faut-il pour un Western blot ?
Au moins trois réplicats biologiques (échantillons ou expériences indépendants), chacun sur son propre gel ou sa propre série de pistes. Les pistes techniques issues du même lysat sont d’abord moyennées. Avec n = 3 par groupe, seuls les effets importants sont détectables : dans notre exemple, l’effet minimal détectable à 80% de puissance est d = 3.07.
Puis-je quantifier un JPEG ou une capture d’écran de mon blot ?
À éviter. La compression JPEG et les captures d’écran modifient les valeurs des pixels et écrêtent souvent les zones claires, ce qui rend les volumes peu fiables. Exportez le fichier original de l’imageur, idéalement un TIFF 16 bits ; le Gel Analyzer le lit en pleine profondeur de bits.
Qu’est-ce que la plage linéaire et comment la vérifier ?
C’est la plage de quantités de protéines sur laquelle le signal de la bande augmente proportionnellement à la quantité déposée. Déposez une série de dilutions d’un même échantillon (par exemple 1, 2, 4, 8 parts) et vérifiez que le signal en fonction de la charge forme une droite. Le Gel Analyzer propose « Check the linear range with a dilution series », qui indique le R² (seuil de réussite 0.98 par défaut).