Western-Blot-Quantifizierung: vom Blotbild zur Statistik
Bei der Western-Blot-Quantifizierung werden Bandenbilder zu vergleichbaren Zahlen: Messen Sie das hintergrundkorrigierte Volumen jeder Bande, normalisieren Sie es auf eine Ladekontrolle in derselben Spur, drücken Sie es als x-fache Änderung gegenüber der Kontrolle aus und testen Sie auf biologischen Replikaten. Diese Anleitung geht jeden Schritt durch und zeigt, wie Sie ihn im kostenlosen Gel Analyzer von LabTools umsetzen.
In dieser Anleitung
- 1. Ein quantifizierbares Bild aufnehmen
- 2. Spuren finden und Banden messen
- 3. Auf eine Ladekontrolle normalisieren
- 4. Replikate und Statistik
- 5. Darstellen und berichten
- Häufig gestellte Fragen
Normalisierte Bandenintensität für vier Bedingungen, alle 12 Spuren gezeigt, mit Tests auf den Mittelwerten der biologischen Replikate (n = 3). Vollständiges Beispiel ansehen
1. Ein quantifizierbares Bild aufnehmen
Die Quantifizierung ist nur so gut wie das Bild. Verwenden Sie die Originaldatei des Imagers, idealerweise ein 16-Bit-TIFF, kein JPEG, keinen Screenshot und keine kontrastbearbeitete Abbildung. Wählen Sie eine Belichtung, bei der die stärkste zu messende Bande nicht gesättigt ist: Eine abgeschnittene Bande wird zu niedrig gemessen, und ihr Volumen ist unbrauchbar.
Öffnen Sie in LabTools den Gel Analyzer und ziehen Sie das Bild hinein (TIFF, PNG, JPG oder BMP), oder verwenden Sie Open from LabTools für ein Bild, das bereits in Ihren Dateien liegt. Der Schritt Image zeigt die Bittiefe, den gesättigten Anteil des Bildes und ob die Banden dunkel auf hell (die meisten Westerns) oder hell auf dunkel sind. Hier können Sie bei Bedarf zuschneiden und ausrichten.
2. Spuren finden und Banden messen
Im Schritt Lanes werden die Spuren für Sie gefunden. Korrigieren Sie bei Bedarf die Anzahl unter How many lanes?, ziehen Sie Spuren im Bild, um sie zu verschieben oder zu neigen, benennen Sie jede Spur und legen Sie ihre Rolle fest: Probe, Marker, Ladekontrolle oder Leerwert.
Im Schritt Bands wird jede Bande gemessen. Das Spurprofil zeigt das Signal von oben nach unten; die gestrichelte Linie ist der abgezogene Hintergrund, und die schattierten Flächen sind das Volumen jeder Bande. Wenn die Basislinie in Banden schneidet, probieren Sie eine andere Background-Methode (Rolling Ball plus Spurbasislinie ist die empfohlene Voreinstellung). Klicken Sie in eine Spur, um eine Bande hinzuzufügen, und ziehen Sie ihre Ränder, um zu ändern, was gezählt wird; bearbeitete Banden werden gelb.
Mit einer Markerspur bestimmt der Schritt Ladder die Größe jeder Bande (bp oder kDa) anhand integrierter DNA- und Proteinmarker oder Ihrer eigenen Größen und zeigt die Anpassung mit ihrem R².
3. Auf eine Ladekontrolle normalisieren
Das rohe Bandenvolumen hängt davon ab, wie viel Protein in die Spur geladen wurde. Im Schritt Results nimmt Quantify (Western blot) die Zielbande und eine Ladekontrolle (ein Klick wählt dieselbe Bande in jeder Spur) und teilt die eine durch die andere:
- Normalize by → Loading control (same lane): die Bande eines Haushaltsproteins wie GAPDH oder Aktin.
- Normalize by → Total lane signal: die ganze Spur, eine Normalisierung im Stil des Gesamtproteins.
- Fold change against: die Kontrollspur, sodass jeder Wert als Vielfaches der Kontrolle zu lesen ist.
Um zu prüfen, ob Sie im linearen Bereich sind, verwenden Sie Check the linear range with a dilution series: Geben Sie die relative Ladungsmenge jeder Verdünnungsspur ein, und LabTools zeigt, wie gerade die Linie aus Signal gegen Ladung für Zielbande und Ladekontrolle verläuft.
4. Replikate und Statistik
Die Analyseeinheit ist das biologische Replikat, nicht die Spur. Spuren aus demselben Lysat sind technische Wiederholungen: Mitteln Sie sie zuerst und vergleichen Sie die Bedingungen dann anhand der Replikatmittelwerte. 12 Spuren als n = 12 zu behandeln, obwohl es 3 biologische Replikate gibt, ist Pseudoreplikation und macht die p-Werte viel zu klein.
Die Schaltfläche Replicates im Gel Analyzer kombiniert mehrere gespeicherte Gele (ein Gel pro Replikat), mittelt Spuren mit gleicher Beschriftung auf einem Gel und liefert Mittelwert, SD und n pro Bedingung, mit einem Welch-t-Test jeder Bedingung gegen die Kontrolle, Holm-korrigiert. Batch wendet eine gespeicherte Analyse auf eine Reihe von Bildern an, damit jedes Gel gleich gemessen wird.
Mit drei Replikaten pro Gruppe können Rangtests keine Signifikanz erreichen (ein Mann–Whitney-Test mit 3 gegen 3 kommt nicht unter p = 0.081), daher ist ein Welch-t-Test mit Korrektur für die Zahl der Vergleiche die übliche Wahl. Im Western-Blot-Beispiel finden Sie alle Tests an realistisch geformten Daten.
5. Darstellen und berichten
Zeigen Sie jeden Datenpunkt, nicht nur einen Balken: Ein Boxplot oder ein Balken mit Punkten macht die Replikatstruktur sichtbar. Senden Sie die Bandentabelle an Charts & Plots, wählen Sie Box Plot und fügen Sie mit Statistical Testing Klammern mit Welch-t-Test und Holm-Bonferroni- oder Benjamini-Hochberg-Korrektur hinzu. Export mit 300–600 dpi oder als SVG/PDF.
Nennen Sie im Methodenteil die Bildquelle und Bittiefe, die Hintergrundmethode, die Normalisierung, die Zahl der biologischen und technischen Replikate und den Test. Die Beispielseite enthält einen Methodenabsatz, den Sie anpassen können.
Häufig gestellte Fragen
Wie quantifiziert man einen Western Blot?
Messen Sie das Volumen jeder Bande (ihr über die Bande summiertes Signal, abzüglich Hintergrund), teilen Sie es durch eine Ladekontrolle aus derselben Spur, setzen Sie es ins Verhältnis zur Kontrollbedingung und vergleichen Sie die Bedingungen auf biologischen Replikaten. Verwenden Sie das Originalbild des Imagers und stellen Sie sicher, dass keine quantifizierte Bande gesättigt ist.
Haushaltsprotein oder Gesamtprotein zur Normalisierung?
Beides ist üblich. Eine Haushaltsprotein-Bande (GAPDH, Aktin, Tubulin) ist einfach, kann aber sättigen oder sich durch die Behandlung verändern; das Gesamtprotein der Spur ist oft robuster. Was Sie auch verwenden, es muss ebenfalls im linearen Bereich liegen. LabTools bietet beides als „Loading control (same lane)“ und „Total lane signal“.
Wie viele Replikate brauche ich für einen Western Blot?
Mindestens drei biologische Replikate (unabhängige Proben oder Experimente), jedes auf einem eigenen Gel oder Spursatz. Technische Spuren aus demselben Lysat werden zuerst gemittelt. Mit n = 3 pro Gruppe sind nur große Effekte nachweisbar: In unserem Beispiel liegt der minimal nachweisbare Effekt bei 80% Power bei d = 3.07.
Kann ich ein JPEG oder einen Screenshot meines Blots quantifizieren?
Besser nicht. JPEG-Kompression und Screenshots verändern Pixelwerte und schneiden oft das helle Ende ab, sodass die Volumen unzuverlässig werden. Exportieren Sie die Originaldatei aus dem Imager, idealerweise ein 16-Bit-TIFF; der Gel Analyzer liest sie in voller Bittiefe.
Was ist der lineare Bereich und wie prüfe ich ihn?
Das ist der Bereich der Proteinmengen, in dem das Bandensignal proportional zur geladenen Menge steigt. Laden Sie eine Verdünnungsreihe einer Probe (zum Beispiel 1, 2, 4, 8 Teile) und prüfen Sie, ob Signal gegen Ladung eine Gerade ergibt. Der Gel Analyzer bietet „Check the linear range with a dilution series“, das R² angibt (Schwelle standardmäßig 0.98).