Western blot క్వాంటిఫికేషన్: blot చిత్రం నుండి గణాంకాల వరకు

క్వాంటిఫికేషన్ నాణ్యత చిత్రం నాణ్యతపై ఆధారపడుతుంది. imager నుండి వచ్చిన అసలు ఫైల్‌ను వాడండి, వీలైతే 16-bit TIFF; JPEG, screenshot లేదా contrast మార్చిన figure వద్దు. మీరు కొలవాలనుకునే అత్యంత బలమైన band saturate కాని exposureను ఎంచుకోండి: clip అయిన band తక్కువగా చదవబడుతుంది, దాని volume వాడలేం.

LabToolsలో Gel Analyzer తెరిచి చిత్రాన్ని లాగి వదలండి (TIFF, PNG, JPG లేదా BMP), లేదా మీ ఫైళ్లలో ఇప్పటికే ఉన్న చిత్రం కోసం Open from LabTools వాడండి. Image దశ bit depth, చిత్రంలో ఎంత saturate అయిందో, bands లేత నేపథ్యంపై ముదురుగా (చాలా Westerns) ఉన్నాయా లేక ముదురు నేపథ్యంపై లేతగా ఉన్నాయా చెబుతుంది. అవసరమైతే ఇక్కడే crop చేసి నిటారుగా సరిచేయండి.

Lanes దశలో lanes ఆటోమేటిక్‌గా కనుగొనబడతాయి. అవసరమైతే How many lanes?లో సంఖ్యను సరిచేయండి, lanesను కదిలించడానికి లేదా వంచడానికి చిత్రంపై లాగండి, ప్రతి laneకు పేరు పెట్టి దాని పాత్రను సెట్ చేయండి: sample, ladder, loading control లేదా blank.

Bands దశలో ప్రతి band కొలవబడుతుంది. lane profile పై నుండి కిందకు signalను చూపిస్తుంది; dashed గీత తీసివేసిన background, షేడ్ చేసిన ప్రాంతాలు ప్రతి band volume. baseline bandsలోకి కోస్తే, మరో Background పద్ధతి ప్రయత్నించండి (rolling ball plus lane baseline సిఫార్సు చేసిన డిఫాల్ట్). band జోడించడానికి laneలో క్లిక్ చేయండి, ఏది లెక్కించబడుతుందో మార్చడానికి దాని అంచులను లాగండి; సవరించిన bands పసుపు రంగుకు మారతాయి.

ladder lane ఉంటే, Ladder దశ అంతర్నిర్మిత DNA, protein ladders లేదా మీ సొంత సైజుల నుండి ప్రతి band సైజును (bp లేదా kDa) లెక్కించి, fitను దాని R²‌తో చూపిస్తుంది.

raw band volume laneలో ఎంత protein వేశారనే దానిపై ఆధారపడుతుంది. Results దశలో, Quantify (Western blot) target bandను, ఒక loading controlను (ఒక్క క్లిక్‌తో ప్రతి laneలో అదే band ఎంపికవుతుంది) తీసుకుని ఒకదాన్ని మరొకదానితో భాగిస్తుంది:

• Normalize by → Loading control (same lane): GAPDH లేదా actin వంటి housekeeping band.
• Normalize by → Total lane signal: మొత్తం lane, total-protein శైలి normalisation.
• Fold change against: control lane; కాబట్టి ప్రతి విలువ controlకు గుణకంగా చదవబడుతుంది.

మీరు linear rangeలో ఉన్నారని నిర్ధారించడానికి, Check the linear range with a dilution series వాడండి: ప్రతి dilution laneలో వేసిన సాపేక్ష పరిమాణాన్ని టైప్ చేయండి; target, loading control కోసం signal-versus-load గీత ఎంత నిటారుగా ఉందో LabTools చెబుతుంది.

విశ్లేషణ యూనిట్ lane కాదు, biological replicate. ఒకే lysate నుండి వచ్చే lanes technical repeats: ముందుగా వాటి సగటు తీసి, తర్వాత replicate సగటులపై పరిస్థితులను పోల్చండి. 3 biological replicates ఉన్నప్పుడు 12 lanesను n = 12గా పరిగణించడం pseudoreplication; ఇది p-valuesను చాలా చిన్నవిగా చేస్తుంది.

Gel Analyzerలోని Replicates బటన్ సేవ్ చేసిన అనేక gelsను (ఒక replicateకు ఒక gel) కలిపి, ఒక gelపై ఒకే label ఉన్న lanes సగటు తీసి, ప్రతి పరిస్థితికి mean, SD, n ఇస్తుంది; ప్రతి పరిస్థితిని controlతో పోల్చే Welch t-test, Holm-adjusted. Batch సేవ్ చేసిన ఒక విశ్లేషణను చిత్రాల సమూహానికి వర్తింపజేస్తుంది; కాబట్టి ప్రతి gel ఒకే విధంగా కొలవబడుతుంది.

ఒక గ్రూప్‌కు మూడు replicates ఉంటే, rank tests significance చేరుకోలేవు (3 vs 3పై Mann–Whitney test p = 0.081 కంటే కిందకు వెళ్లదు); కాబట్టి పోలికల సంఖ్యకు correctionతో Welch t-test సాధారణ ఎంపిక. నిజమైన ఆకృతి డేటాపై పూర్తి tests కోసం western blot ఉదాహరణ చూడండి.

bar మాత్రమే కాదు, ప్రతి data point చూపండి: box plot లేదా points ఉన్న bar replicate నిర్మాణాన్ని స్పష్టం చేస్తుంది. band tableను Charts & Plotsకు పంపి, Box Plot ఎంచుకుని, Welch's t-test మరియు Holm-Bonferroni లేదా Benjamini-Hochberg correctionతో brackets జోడించడానికి Statistical Testing వాడండి. 300–600 dpiలో లేదా SVG/PDFగా Export చేయండి.

methods విభాగంలో చిత్ర మూలం, bit depth, background పద్ధతి, normalisation, biological మరియు technical replicates సంఖ్య, test పేర్కొనండి. ఉదాహరణ పేజీలో మీరు అనుకూలంగా మార్చుకోగల methods పేరా ఉంది.