Quantificação de Western blot: da imagem do blot à estatística
A quantificação de Western blot transforma imagens de bandas em números comparáveis: meça o volume de cada banda após subtrair o fundo, normalize por um controle de carga da mesma canaleta, expresse como fold change em relação ao controle e faça os testes sobre réplicas biológicas. Este guia percorre cada passo e mostra como fazer isso no Gel Analyzer gratuito do LabTools.
Neste guia
- 1. Obtenha uma imagem que possa ser quantificada
- 2. Encontre as canaletas e meça as bandas
- 3. Normalize por um controle de carga
- 4. Réplicas e estatística
- 5. Faça o gráfico e relate
- Perguntas frequentes
Intensidade normalizada das bandas para quatro condições, com as 12 canaletas mostradas e testes sobre as médias das réplicas biológicas (n = 3). Ver o exemplo completo
1. Obtenha uma imagem que possa ser quantificada
A quantificação só é tão boa quanto a imagem. Use o arquivo original do fotodocumentador, de preferência um TIFF de 16 bits, e não um JPEG, uma captura de tela ou uma figura com contraste ajustado. Escolha uma exposição em que a banda mais forte que você quer medir não esteja saturada: uma banda cortada dá um valor baixo demais e seu volume não pode ser usado.
No LabTools, abra o Gel Analyzer e solte a imagem (TIFF, PNG, JPG ou BMP), ou use Open from LabTools para uma imagem que já está nos seus arquivos. A etapa Image informa a profundidade de bits, quanto da imagem está saturado e se as bandas são escuras sobre fundo claro (a maioria dos Westerns) ou claras sobre fundo escuro. Recorte e endireite aqui, se precisar.
2. Encontre as canaletas e meça as bandas
Na etapa Lanes as canaletas são encontradas para você. Corrija o número em How many lanes? se necessário, arraste as canaletas na imagem para movê-las ou incliná-las, dê um nome a cada uma e defina sua função: amostra, marcador, controle de carga ou branco.
Na etapa Bands cada banda é medida. O perfil da canaleta mostra o sinal de cima para baixo; a linha tracejada é o fundo subtraído e as áreas sombreadas são o volume de cada banda. Se a linha de base cortar as bandas, tente outro método de Background (rolling ball mais linha de base da canaleta é o padrão recomendado). Clique em uma canaleta para adicionar uma banda e arraste as bordas para mudar o que é contado; bandas editadas ficam amarelas.
Com uma canaleta de marcador, a etapa Ladder atribui tamanho a cada banda (pb ou kDa) a partir de marcadores de DNA e proteína integrados ou dos seus próprios tamanhos, e mostra o ajuste com seu R².
3. Normalize por um controle de carga
O volume bruto de uma banda depende de quanta proteína foi aplicada na canaleta. Na etapa Results, Quantify (Western blot) pega a banda-alvo e um controle de carga (um clique escolhe a mesma banda em todas as canaletas) e divide uma pela outra:
- Normalize by → Loading control (same lane): uma banda de proteína constitutiva (housekeeping), como GAPDH ou actina.
- Normalize by → Total lane signal: a canaleta inteira, uma normalização do tipo proteína total.
- Fold change against: a canaleta controle, para que cada valor seja lido como múltiplo do controle.
Para confirmar que você está na faixa linear, use Check the linear range with a dilution series: digite a quantidade relativa aplicada em cada canaleta da diluição e o LabTools informa quão reta é a relação sinal-carga para o alvo e para o controle de carga.
4. Réplicas e estatística
A unidade de análise é a réplica biológica, não a canaleta. Canaletas do mesmo lisado são repetições técnicas: tire a média delas primeiro e depois compare as condições pelas médias das réplicas. Tratar 12 canaletas como n = 12 quando há 3 réplicas biológicas é pseudorreplicação e deixa os valores de p pequenos demais.
O botão Replicates do Gel Analyzer combina vários géis salvos (um gel por réplica), tira a média das canaletas com o mesmo rótulo em um gel e dá a média, o DP e o n por condição, com um teste t de Welch de cada condição contra o controle, ajustado por Holm. Batch aplica uma análise salva a um conjunto de imagens para que todos os géis sejam medidos da mesma forma.
Com três réplicas por grupo, os testes de postos não conseguem atingir significância (um teste de Mann–Whitney com 3 contra 3 não fica abaixo de p = 0.081), então o habitual é um teste t de Welch com correção para o número de comparações. Veja o exemplo de Western blot para o conjunto completo de testes em dados com formato realista.
5. Faça o gráfico e relate
Mostre todos os pontos, não só uma barra: um boxplot ou uma barra com pontos deixa a estrutura das réplicas visível. Envie a tabela de bandas para Charts & Plots, escolha Box Plot e use Statistical Testing para adicionar colchetes com o teste t de Welch e uma correção de Holm-Bonferroni ou de Benjamini-Hochberg. Use Export a 300–600 dpi ou como SVG/PDF.
Nos métodos, informe a origem da imagem e a profundidade de bits, o método de fundo, a normalização, o número de réplicas biológicas e técnicas e o teste. A página do exemplo tem um parágrafo de métodos que você pode adaptar.
Perguntas frequentes
Como quantificar um Western blot?
Meça o volume de cada banda (o sinal somado sobre a banda, com o fundo subtraído), divida por um controle de carga da mesma canaleta, expresse em relação à condição controle e compare as condições usando réplicas biológicas. Use a imagem original do fotodocumentador e garanta que nenhuma banda quantificada esteja saturada.
Proteína constitutiva ou proteína total para normalizar?
As duas são usadas. Uma banda constitutiva (GAPDH, actina, tubulina) é simples, mas pode saturar ou mudar com o tratamento; a proteína total da canaleta costuma ser mais robusta. Qualquer que seja a escolha, ela também precisa estar na faixa linear. O LabTools oferece as duas como “Loading control (same lane)” e “Total lane signal”.
Quantas réplicas preciso para um Western blot?
Pelo menos três réplicas biológicas (amostras ou experimentos independentes), cada uma em seu próprio gel ou conjunto de canaletas. Canaletas técnicas do mesmo lisado são promediadas primeiro. Com n = 3 por grupo só efeitos grandes são detectáveis: no nosso exemplo, o efeito mínimo detectável com 80% de poder é d = 3.07.
Posso quantificar um JPEG ou uma captura de tela do meu blot?
Evite. A compressão JPEG e as capturas de tela mudam os valores dos pixels e muitas vezes cortam a parte mais clara, então os volumes deixam de ser confiáveis. Exporte o arquivo original do fotodocumentador, de preferência um TIFF de 16 bits; o Gel Analyzer o lê com a profundidade de bits completa.
O que é a faixa linear e como verifico?
É a faixa de cargas de proteína em que o sinal da banda sobe na proporção da quantidade aplicada. Aplique uma série de diluições de uma amostra (por exemplo 1, 2, 4 e 8 partes) e verifique se o sinal contra a carga forma uma reta. O Gel Analyzer tem “Check the linear range with a dilution series”, que informa o R² (aprovação em 0.98 por padrão).