Western blot அளவீடு: blot படத்திலிருந்து புள்ளியியல் வரை

அளவீட்டின் தரம் படத்தின் தரத்தைப் பொறுத்தது. imager-இலிருந்து வந்த அசல் கோப்பைப் பயன்படுத்துங்கள், முடிந்தால் 16-bit TIFF; JPEG, screenshot அல்லது contrast மாற்றிய figure வேண்டாம். நீங்கள் அளவிட விரும்பும் மிக வலுவான band saturate ஆகாத exposure-ஐத் தேர்ந்தெடுங்கள்: clip ஆன band குறைவாகப் படிக்கப்படும், அதன் volume-ஐப் பயன்படுத்த முடியாது.

LabTools-இல் Gel Analyzer-ஐத் திறந்து படத்தை இழுத்துவிடுங்கள் (TIFF, PNG, JPG அல்லது BMP), அல்லது உங்கள் கோப்புகளில் ஏற்கனவே உள்ள படத்துக்கு Open from LabTools-ஐப் பயன்படுத்துங்கள். Image படி bit depth, படத்தில் எவ்வளவு saturate ஆகியுள்ளது, bands வெளிர் பின்னணியில் கருமையாக (பெரும்பாலான Westerns) உள்ளனவா அல்லது கருமையான பின்னணியில் வெளிராக உள்ளனவா என்று காட்டும். தேவைப்பட்டால் இங்கே crop செய்து நேராக்குங்கள்.

Lanes படியில் lanes தானாகக் கண்டறியப்படும். தேவைப்பட்டால் How many lanes?-இல் எண்ணிக்கையைச் சரிசெய்யுங்கள், lanes-ஐ நகர்த்த அல்லது சாய்க்கப் படத்தின் மீது இழுங்கள், ஒவ்வொரு lane-க்கும் பெயரிட்டு அதன் பங்கை அமையுங்கள்: sample, ladder, loading control அல்லது blank.

Bands படியில் ஒவ்வொரு band-உம் அளவிடப்படும். lane profile மேலிருந்து கீழாக signal-ஐக் காட்டுகிறது; dashed கோடு கழிக்கப்பட்ட background, நிழலிட்ட பகுதிகள் ஒவ்வொரு band-இன் volume. baseline bands-க்குள் வெட்டினால், வேறு Background முறையை முயலுங்கள் (rolling ball plus lane baseline பரிந்துரைக்கப்பட்ட இயல்புநிலை). band சேர்க்க lane-இல் கிளிக் செய்யுங்கள், எது கணக்கிடப்படுகிறது என்பதை மாற்ற அதன் ஓரங்களை இழுங்கள்; திருத்திய bands மஞ்சளாக மாறும்.

ladder lane இருந்தால், Ladder படி உள்ளமைந்த DNA, protein ladders அல்லது உங்கள் சொந்த அளவுகளிலிருந்து ஒவ்வொரு band-இன் அளவையும் (bp அல்லது kDa) கணக்கிட்டு, fit-ஐ அதன் R² உடன் காட்டும்.

raw band volume lane-இல் எவ்வளவு protein ஏற்றப்பட்டது என்பதைப் பொறுத்தது. Results படியில், Quantify (Western blot) target band-ஐயும் ஒரு loading control-ஐயும் (ஒரே கிளிக்கில் ஒவ்வொரு lane-இலும் அதே band தேர்வாகும்) எடுத்து ஒன்றை மற்றொன்றால் வகுக்கிறது:

• Normalize by → Loading control (same lane): GAPDH அல்லது actin போன்ற housekeeping band.
• Normalize by → Total lane signal: முழு lane, total-protein பாணி normalisation.
• Fold change against: control lane; எனவே ஒவ்வொரு மதிப்பும் control-இன் மடங்காகப் படிக்கப்படும்.

நீங்கள் linear range-இல் இருக்கிறீர்கள் என்று உறுதிப்படுத்த, Check the linear range with a dilution series-ஐப் பயன்படுத்துங்கள்: ஒவ்வொரு dilution lane-இலும் ஏற்றிய சார்பு அளவைத் தட்டச்சு செய்யுங்கள்; target மற்றும் loading control-க்கு signal-versus-load கோடு எவ்வளவு நேராக உள்ளது என்று LabTools காட்டும்.

பகுப்பாய்வின் அலகு lane அல்ல, biological replicate. ஒரே lysate-இலிருந்து வரும் lanes technical repeats: முதலில் அவற்றைச் சராசரி செய்து, பிறகு replicate சராசரிகளின் மீது நிலைகளை ஒப்பிடுங்கள். 3 biological replicates இருக்கும்போது 12 lanes-ஐ n = 12 ஆகக் கருதுவது pseudoreplication; இது p-values-ஐ மிக மிகச் சிறியதாக்கிவிடும்.

Gel Analyzer-இன் Replicates பொத்தான் சேமித்த பல gels-ஐ (ஒரு replicate-க்கு ஒரு gel) இணைத்து, ஒரு gel-இல் ஒரே label உள்ள lanes-ஐச் சராசரி செய்து, ஒவ்வொரு நிலைக்கும் mean, SD, n-ஐத் தருகிறது; ஒவ்வொரு நிலையையும் control-உடன் ஒப்பிடும் Welch t-test, Holm-adjusted. Batch சேமித்த ஒரு பகுப்பாய்வைப் படங்களின் தொகுப்புக்குப் பயன்படுத்துகிறது; எனவே ஒவ்வொரு gel-உம் ஒரே முறையில் அளவிடப்படும்.

ஒரு குழுவுக்கு மூன்று replicates இருந்தால், rank tests significance-ஐ அடைய முடியாது (3 vs 3 மீது Mann–Whitney test p = 0.081-க்குக் கீழே போக முடியாது); எனவே ஒப்பீடுகளின் எண்ணிக்கைக்கான correction உடன் Welch t-test வழக்கமான தேர்வு. உண்மை வடிவத் தரவில் முழு tests-க்கு western blot எடுத்துக்காட்டைப் பாருங்கள்.

bar மட்டுமல்ல, ஒவ்வொரு data point-ஐயும் காட்டுங்கள்: box plot அல்லது points உடன் bar, replicate கட்டமைப்பைத் தெளிவாக்கும். band table-ஐ Charts & Plots-க்கு அனுப்பி, Box Plot-ஐத் தேர்ந்தெடுத்து, Welch's t-test மற்றும் Holm-Bonferroni அல்லது Benjamini-Hochberg correction உடன் brackets சேர்க்க Statistical Testing-ஐப் பயன்படுத்துங்கள். 300–600 dpi-இல் அல்லது SVG/PDF ஆக Export செய்யுங்கள்.

methods பகுதியில் பட மூலம் மற்றும் bit depth, background முறை, normalisation, biological மற்றும் technical replicates எண்ணிக்கை, test ஆகியவற்றைக் குறிப்பிடுங்கள். எடுத்துக்காட்டுப் பக்கத்தில் நீங்கள் தழுவிக்கொள்ளக்கூடிய ஒரு methods பத்தி உள்ளது.