ウェスタンブロットの定量：ブロット画像から統計まで
ウェスタンブロットの定量では、バンドの画像を比較可能な数値に変換します。各バンドのバックグラウンド除去後の体積を測り、同じレーンのローディングコントロールで正規化し、コントロールに対するフォールドチェンジとして表し、生物学的反復で検定します。このガイドでは各ステップを順に説明し、無料の LabTools Gel Analyzer での方法を紹介します。
このガイドの内容
4 条件の正規化バンド強度。12 レーンすべてを表示し、検定は生物学的反復の平均値（n = 3）に対して行っています。 作例の全体を見る
1. 定量できる画像を取得する
定量の質は画像の質で決まります。JPEG、スクリーンショット、コントラストを調整した図ではなく、イメージャーから出力された元のファイル（できれば 16 ビット TIFF）を使ってください。測定したい最も強いバンドが飽和しない露光時間を選びます。飽和したバンドは実際より低く読み取られ、その体積は使えません。
LabTools で Gel Analyzer を開き、画像（TIFF、PNG、JPG、BMP）をドロップするか、すでにファイルにある画像なら Open from LabTools を使います。Image ステップでは、ビット深度、画像のうち飽和している割合、バンドが明るい背景に暗く写っているか（ほとんどのウェスタン）、暗い背景に明るく写っているかが表示されます。必要ならここで切り抜きと傾き補正を行います。
2. レーンを見つけてバンドを測定する
Lanes ステップでは、レーンが自動で検出されます。必要に応じて How many lanes? でレーン数を修正し、画像上でレーンをドラッグして移動・傾け、各レーンに名前と役割（サンプル、ラダー、ローディングコントロール、ブランク）を設定します。
Bands ステップでは、すべてのバンドが測定されます。レーンプロファイルは上から下へのシグナルを示し、破線は差し引かれるバックグラウンド、網掛け部分は各バンドの体積です。ベースラインがバンドに食い込んでいる場合は、別の Background 方式を試してください（推奨の既定はローリングボール＋レーンベースライン）。レーン内をクリックするとバンドを追加でき、端をドラッグすると数える範囲を変えられます。編集したバンドは黄色になります。
ラダーレーンがある場合、Ladder ステップで、内蔵の DNA・タンパク質ラダーまたは独自のサイズから各バンドのサイズ（bp または kDa）を求め、フィットとその R² を表示します。
3. ローディングコントロールで正規化する
バンドの体積そのものは、レーンにアプライしたタンパク質の量に左右されます。Results ステップの Quantify (Western blot) では、標的バンドとローディングコントロール（ワンクリックで全レーンの同じバンドを選択）を指定し、一方を他方で割ります：
- Normalize by → Loading control (same lane)：GAPDH やアクチンなどのハウスキーピングタンパク質のバンド。
- Normalize by → Total lane signal：レーン全体を使う、総タンパク質型の正規化。
- Fold change against：コントロールのレーン。すべての値がコントロールの何倍かで表されます。
直線範囲内にあることを確認するには、Check the linear range with a dilution series を使います。各希釈レーンのアプライ量の相対値を入力すると、標的とローディングコントロールそれぞれについて、シグナルとアプライ量の関係がどれだけ直線的かが表示されます。
4. 反復と統計
解析の単位はレーンではなく生物学的反復です。同じライセートから流したレーンは技術的反復なので、まず平均し、その反復ごとの平均値で条件を比較します。生物学的反復が 3 つしかないのに 12 レーンを n = 12 として扱うのは擬似反復であり、p 値が過度に小さくなります。
Gel Analyzer の Replicates ボタンは、保存した複数のゲル（反復ごとに 1 枚）をまとめ、ゲル内で同じラベルのレーンを平均し、条件ごとの平均、SD、n を求めて、各条件とコントロールを Welch の t 検定（Holm 補正）で比較します。Batch は保存した一つの解析を画像のセットに適用するので、すべてのゲルが同じ方法で測定されます。
1 群あたり 3 反復では順位検定で有意差に達することができません（3 対 3 の Mann–Whitney 検定は p = 0.081 を下回れません）。そのため、比較の数に応じた補正をかけた Welch の t 検定が一般的な選択です。実データに近い形のデータでの検定一式はウェスタンブロットの作例をご覧ください。
5. プロットと報告
棒だけでなく、すべてのデータ点を示しましょう。箱ひげ図や点付きの棒グラフなら反復の構造が見えます。バンドの表を Charts & Plots に送り、Box Plot を選び、Statistical Testing で Welch の t 検定と Holm-Bonferroni または Benjamini-Hochberg 補正のブラケットを追加します。Export で 300〜600 dpi、または SVG/PDF として出力します。
方法には、画像の取得元とビット深度、バックグラウンドの方式、正規化、生物学的反復と技術的反復の数、検定を記載してください。作例のページに、そのまま応用できる方法の記載例があります。
よくある質問
ウェスタンブロットはどうやって定量しますか？
各バンドの体積（バックグラウンドを差し引いた、バンド全体のシグナルの合計）を測り、同じレーンのローディングコントロールで割り、コントロール条件に対する相対値で表し、生物学的反復で条件を比較します。イメージャーから出力された元の画像を使い、定量するバンドが飽和していないことを確認してください。
正規化にはハウスキーピングタンパク質と総タンパク質のどちらを使いますか？
どちらも使われます。ハウスキーピングタンパク質のバンド（GAPDH、アクチン、チューブリン）は手軽ですが、飽和したり処理によって変動したりすることがあります。レーン内の総タンパク質の方が頑健なことが多いです。どちらを使う場合も、それ自体が直線範囲内にある必要があります。LabTools ではどちらも「Loading control (same lane)」と「Total lane signal」として選べます。
ウェスタンブロットには何回の反復が必要ですか？
少なくとも 3 つの生物学的反復（独立したサンプルまたは実験）が必要で、それぞれ別のゲルまたは別のレーンセットで流します。同じライセートからの技術的なレーンはまず平均します。1 群 n = 3 では大きな効果しか検出できません。この作例では、検出力 80% での最小検出可能効果は d = 3.07 です。
ブロットの JPEG やスクリーンショットで定量できますか？
避けてください。JPEG 圧縮やスクリーンショットはピクセル値を変え、明るい側が切り捨てられることも多いため、体積が信頼できなくなります。イメージャーから元のファイル（できれば 16 ビット TIFF）を出力してください。Gel Analyzer はフルのビット深度で読み込みます。
直線範囲とは何で、どうやって確認しますか？
バンドのシグナルがアプライしたタンパク質量に比例して増える範囲のことです。1 つのサンプルの希釈系列（例えば 1、2、4、8 の比）を流し、シグナルとアプライ量の関係が直線になっているか確認します。Gel Analyzer には「Check the linear range with a dilution series」があり、R² を表示します（既定の合格基準は 0.98）。